Tecnicas

MICROSCOPIA ELECTRONICA DE TRANSMISIÓN
La microscopia electrónica de transmisión (MET) aplicada a las ciencias de la vida permite estudiar a nivel celular y subcelular, citoquímico e immunocitoquímico muestras biológicas, tejidos animales y vegetales, cultivos celulares y bacterianos, virus, estructuras subcelulares, y macromoléculas.
El microscopio electrónico de transmisión es un instrumento que utiliza como fuente de iluminación un haz de electrones que son generados por un filamento de tungsteno cuando este por efecto termoiónico se pone incandescente. Estos electrones son acelerados y dirigidos hacia la muestra mediante lentes electromagnéticas en condiciones de alto vacío.
Con el fin de observar la muestra en el microscopio electrónico de transmisión hay que prepararla previamente según métodos específicos de fijación, inclusión ultramicrotomía, o crioultramicrotomía. La imagen que se obtiene es plana y monocromática (en blanco y negro) y se puede llegar a un límite de resolución de 0.3 nm.



    Prestaciones:

  • Procesado convencional de muestras para microscopia electrónica de transmisión que comprende: Fijación química, deshidratación, e, inclusión en resinas (Epon, Spurr, LR White etc.….) así como la obtención de secciones finas y ultrafinas debidamente contrastadas  para observar  al microscopio.
  • Procesado de muestras  con fijación por congelación para hacer estudios de inmunocitoquímica las técnicas utilizadas son:
  • a)Crioultramicrotomía. Consiste en la realización de cortes ultrafinos por congelación)
  • b)Criosubstitución y PLT Esta técnica consiste en realizar la substitución del agua del material fijado por congelación por otros agentes de inclusión y todo este proceso se hace  a baja temperatura
  • La PLT consiste en realizar procesos de inclusión, de materiales fijados químicamente; pero se realiza  una  reducción progresiva de la  temperatura  en los  pasos de deshidratación , inclusión y polimerización en diferentes resinas
  • Fijación a Alta presión permite la congelación de muestras de 200μm de espesor, sin los artefactos de la fijación química. Con este sistema se pueden observar muestras biológicas e industrial preservando el estado nativo y por tanto la información que se obtiene es real. El equipo que tenemos   cuenta con el sistema de transferencia rápida (5sg) para poder realizar estudios correlativos entre microscopia de luz y microcopio confocal o microscopía electrónica de transmisión.
  • Tinción negativa y sombreados con metales pesados de materiales particulados.
  • Técnicas de inmunocitoquímica y otras técnicas especiales.

  Equipamiento:

  • Tres ultramicrotomos Leica Ultracut (UCT, UC6 )
  • Dos Ultramicrotomos REICHERT, y LEICA
  • Sistema de Crioultramicrotomía LEICA. que comprende:Ultracut UCT Leica al cual se le adapta la cámara Leica EM FCS. Este sistema permite realizar secciones ultrafinas a baja temperatura -185ºC de muestras biológicas e industriales.
  • Sistema de Criosustitución LEICA AFS EM Leica
  • Sistema de Alta presión PACT2 EM Leica con sistema transferencia rápida RTS EM
  • Sistema de Criofijación REICHERT KF80
  • Microscopio Electrónico PHILIPS TECNAI 12. De 120Kv.: Posee Sistema de Microanálisis por dispersión de Rayos X y captación de imágenes. Permite trabajar de 5 hasta 120 kv, en forma continua, Está conectado a red y los usuarios pueden adquirir las imágenes desde sus puestos de trabajo.
  • Microscopio Electrónico de Transmisión ZEISS EM10: Utilizado para investigación básica permite observaciones desde 30x hasta 500.00x aumentos directos en pantalla, con capacidad de resolución 0,1nm entre líneas y 0,3 nm entre puntos. Utiliza para fotografía película plana de 6,5 x 9 cm.
  • Microscopio Electrónico de Transmisión ZEISS EM 109: Utilizado en investigación para exámenes de rutina. Esta automatizado y es de muy fácil manejo.
  • Laboratorio de fotografía.
  • Accesorios: estufas, balanzas, centrífugas, campanas de extracción, etc.

Aplicaciones

  • Estudio ultraestructural de células y tejidos normales y patológicos.
  • Morfología y ultraestructura de microorganismos.
  • Localización y diagnóstico de virus.
  • Caracterización inmunocitoquímica e histoquímica de distintos tipos celulares.
  • Comprobación morfológica de tratamientos terapéuticos experimentales.
  • Estudio ultraestructural de suspensiones celulares y orgánulos aislados.
  • Estudios ultraestructurales en diferentes tejidos y células de los efectos que producen los tratamientos con diferentes fármacos en una experimentación concreta.
  • Estudios de ultraestructurales de de marcaje con  técnicas de hibridación in situ.
  • Estudios a nivel ultraestructural de los efectos producidos en una célula o un  tejido determinado después de realizar una experimentación  de tipo fisiológico.
  • Tipificación de distintos tipos celulares en sus distintos estadios de desarrollo, en estado  normal y patológico.
  • Estudios sobre ocupación de los distintos orgánulos celulares en relación al estado  celular.

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO

El microscopio electrónico de barrido  (SEM) se utiliza para obtener imágenes de gran resolución de los rasgos topográficos superficiales de los objetos, su fundamento consiste en hacer interaccionar un haz primario de electrones sobre un área del objeto que se pretende estudiar. El haz debe ser muy fino, intenso y estable porque su función es explorar la superficie de la muestra, dando lugar a diversas señales que serán recogidas por diferentes detectores, de señales, y nos darán una información morfológica  estructural y microanalítica según el detector que se haya utilizado o interese.Las muestras  para ser observadas al microscopio electrónico de barrido deben estar libres de líquidos y además si no son conductoras deber ser recubiertas con material conductor Una de las características principales de la microscopia electrónica de barrido es la gran versatilidad en las aplicaciones tanto en el campo de las ciencias de materiales como en las ciencias biomédicas.

Prestaciones

  • Procesamiento de  muestras húmedas siguiendo los siguientes pasos: lavado, fijación, secado mediante técnica de punto crítico y recubrimiento del material con oro o carbono
  • Tratamiento de muestra húmedas mediante la tecnología QuantomiX WETSEM Este sistema  permite el estudio de muestra húmedas tanto para obtener imágenes como para realizar estudios de microanálisis con electrones de rayos X conservando su estado nativo.
  •  Recubrimiento con oro para la observación de imágenes con electrones secundarios  de muestras duras no conductivas.
  • Recubrimiento de muestras con carbono si se trata de realizar un estudio microanalítico con electrones de rayos X

Equipamiento

  • Microscopio de Barrido JEOL-6100 y Sistema de Microanálisis por dispersión de Rayos X INCA  de Oxford Instrument. Permite trabajar de 1 a 30 Kv, de forma continua.Tiene incorporados detector de Rayos X y de electrones retrodispersados y un sistema de captación de imágenes digital.
  • Equipo para realizar punto crítico   BALZERS UNION C-020
  • Equipo para realizar punto crítico Leica EM CPD 030
  • Evaporador de metales oro y carbono por emisión iónica BIORAD- POLARON
  • Evaporador de carbón POLARON
  • Desecador para almacenar las muestras

Aplicaciones

  • Estudios de morfología y topografía en general, hasta resoluciones de 4 nm, tanto en el campo biomédico como en el de los materiales.
  • Microanálisis elemental: permite conocer los elementos químicos presentes en las diferentes partes de una muestra, en un volumen tan pequeño como un micrómetro cúbico.
  • También permite realizar un maping para  ver la distribución de los  elementos químicos  que tiene  la muestra y, en muchos casos, cuantificarlos.
  • Análisis de partículas. Estructura de alimentos. Contaminantes. Procesos de corrosión. Caracterización de recubrimientos y de estructuras metalúrgicas y cerámicas. Capas pictóricas. Microelectrónica. Aplicaciones forenses. Controles de calidad. Aplicaciones biomédicas: estudio de cultivos celulares, tejidos y órganos etc.
  • Valoración del deterioro de materiales ,estudios y análisis de pinturas.
  • Observación de materiales aislantes que necesitan recubrimiento con oro o carbón
  • Estudios de Parasitología y enfermedades parasitarias.

 

MICROSCOPIA ÓPTICA

La microscopía óptica ha sido utilizada siempre como técnica básica en estudios de morfología general. Pero  hoy la Biología Celular junto a la Biología Molecular han dado un gran salto en el estudio de las estructuras a nivel molecular haciendo que la técnicas de inmunohistoquímica e inmunocitoquímica sean tan importantes en microscopía óptica como lo pueden ser en microscopía electrónica por tanto la  inclusión en parafina sigue siendo una técnica básica para realizar estos estudios

Otras técnicas muy utilizadas para mejorar la resolución en la observación del estudio de la muestras son las inclusiones en plástico que permiten realizar secciones finas de 2µm a diferencia del material incluido en parafina que esto no es posible.

Prestaciones

  • Inclusiones convencionales en parafina de material animal y vegetal
  • Inclusiones en resinas  JB-4, IMPLEX, TENCHOVIT etc.
  • Realización de secciones de material incluido en parafina y plástico
  • Tinciones convencionales y especiales :Hematoxilina y Eosina, tricrómico, rojo congo etc.
  • Realización de cortes por congelación en  Crióstato.
  • Procesamiento de materiales no descalcificados: huesos., dientes etc. Las muestras deben ser tratadas partiendo de una fijación, deshidratación e inclusión en resinas epoxi o similar calidad. La inclusión determinará en gran medida la calidad de las secciones que se realizarán posteriormente.
  • Realización de secciones de 0,3 mm. de grosor con una Sierra Diamantada EXAKT de muestras anatómicas, dientes sin descalcificar y con implantes de materiales como titanio.

Aplicaciones

  • La microscopía óptica tiene aplicaciones  en   Ciencia básica y aplicada en las áreas de:   Biología, Biotecnología, Ciencias  de la Salud, Ciencias forenses, Ciencias     agropecuarias, Ciencias de los materiales, Geología, Arqueología, Metalurgia etc.

Equipamiento

  • Microscopio Óptico Leica DMRB  con cámara digital Leica DC500    Tiene óptica de fluorita  en todos los objetivos para las técnicas de luz transmitida .Esta dotado para observar con las técnicas de luz visible tales: como contraste de fases, contraste interferencial, polarización por luz incidente y transmitida. También    tiene la técnica de Fluorescencia por luz incidente.
  • Microtomo motorizado RM 2155 LEICA. Permite realizar cortes para microscopia óptica de material incluido en parafina y plásticos.
  • Criostato LEICA CM 3050S. Permite realizar cortes por congelación de muestras  que no han  sido fijadas previamente (alrededor de -25º C)  y  para     tejidos fijados   las temperaturas  que se precisan       son superiores (alrededor de -10 C). Está dotado con  un sistema de control independiente de  la muestra  respecto de temperatura  de  la cámara.Las cortes que se hacen con este  tipo de microtomía pueden utilizarse para técnicas de tinción rutinarias porque es una forma rápida de realizar diagnóstico rápido; pero son especialmente utilizadas para técnicas histoenzimáticas e inmunohistoquímicas  Son útiles    también para la demostración de sustancias solubles que no resisten el proceso de    deshidratación como son los lípidos
  • Sierra Banda EXAKT Permite obtener de forma automática secciones de 0,3 mm. de grosor .Es un equipo especializado para este tipo de muestras que  dispone de una unidad   central corte dotada de un dispositivo de control de precisión con cabezal oscilante.
  • Unidad de Micropulido EXAKT esta             compuesta por:

-Unidad básica de micropulido.
-Digital completo AW-10.
-Platina de pulido.
-Bomba de vacío Nº 22 AN18.
-Botella de lavado para bomba de vacío.
-Unidad micrométrica (0 – 25 mm)

Estos equipos son utilizados  en las áreas de Anatomía y Odontología para realizar estudios histológicos de materiales duros sin descalcificar Da la posibilidad de obtener secciones finas (20µm) en muestras de hueso y odontológicas, incluso con esmalte e implantes duros, que posteriormente pueden ser teñidas con diferentes técnicas histológicas.

MICROSCOPÍA CONFOCAL

A diferencia de la microscopía de fluorescencia convencional permite eliminar la señal de fluorescencia que está fuera de foco de una muestra semitranslucida. Otra ventaja es que se pueden obtener de forma no destructiva secciones ópticas de distintos planos de la muestra. Las secciones ópticas obtenidas contienen la información para poder hacer  realizar posteriormente un análisis tridimensional: cuantificación análisis volumétrico de la colocalización, distribución de fluorescencia etc. para la observación de la parte interna de una muestra.

La microscopía confocal  permite aumentar  la  resolución óptica y el contraste de las imágenes,  ventajas que son necesarias para los estudios de colocalización.

 La microscopía confocal de reflexión es una aplicación donde no es necesario aplicar marcajes fluorescentes, lo que se utiliza es la iluminación reflectada por la muestra. Esta técnica puede ser de gran utilidad para el análisis de superficies.



Equipamiento

  •  MICROSCOPIO CONFOCAL  ESPECTRAL  LEICA TCS-SP2 CON PUERTO PARA  LUZ ULTRA VIOLETA integrado por los siguiente dispositivos:-
  • Microscopio invertido de investigación DMIR2  con óptica Plan Apo CS para  las técnicas de  campo claro, contraste Interferencial  y fluorescencia en luz  incidente.
  • El Modulo Confocal Espectral esta compuesto por  siguientes dispositivos :
  • Sistema modulador del haz óptico sintonizable y Cuatro láseres  y un    diodo azul  estos dispositivos están acoplados al modulo confocal mediante fibra óptica para   garantizar la estabilidad del sistema :

  AOBS-Divisor de Haz Acústico Óptico

Láser de Argón (458nm,476nm,488,514nm

 Diodo azul 405nm

 Láser de Helio-Neón 543nm

 Láser Naranja 594nm

         Láser de Helio-Neón 633nm

  • MICROSCOPIO CONFOCAL  CON CAMARA DIGITAL NIKON 90i compuesto por: Microscopio automático  directo Nikon Eclipse 90i   con óptica plana para todas las    técnicas de luz visible y flluorescencia con luz incidente.

  Camára digital  refrigerada DXM 1200C.

  Módulo Confocal D-eclipse C1 con  los láseres siguientes:

           Diodo azul 408nm

         Láser de Argón 488nm

          Láser de Helio-Neón 5433nm

Todos estos microscopios tienen programas para  captar de imágenes en 3D y de en los 3 ejes  X,Y,Z así como sistemas sencillos par analizar intensidades de fluorescencia.

APLICACIONES

  • Detección de marcajes immunocitoquímicos mediante anticuerpos marcados con fluorocromos tanto en cultivos celulares como en tejidos histológicos y “whole mount”.
  • Hibridación in situ con sondas fluorescentes (FISH).
  • Análisis de células in vivo y a tiempo real mediante marcadores y/o proteínas de fusión fluorescentes (GPF) y derivados.
  • Estudios de colocalización, de internalización y tráfico intracelular.
  • Análisis fisiológico de respuesta de Ca2+.
  • Estudio de interacciones entre proteínas mediante la técnica FRET (fluorescence resonance energy transfer)
  • Estudio de transporte de proteínas mediante la técnica FRAP (fluorescence recovery after photo-bleaching).
  • Posibilidad de trabajar con secciones ópticas tanto horizontales como verticales.. Obtención de imágenes digitales fácilmente exportables y transformables a otros apoyos y soportes.
  • Análisis de células in vivo y en tiempo real mediante marcadores y/o proteínas de fusión fluorescentes.
  • Desarrollo de metodologías para el análisis in vivo de células, estudios fisiológicos y análisis de interacción entre proteínas.

 

Deja un comentario

Introduce tus datos o haz clic en un icono para iniciar sesión:

Logo de WordPress.com

Estás comentando usando tu cuenta de WordPress.com. Cerrar sesión / Cambiar )

Imagen de Twitter

Estás comentando usando tu cuenta de Twitter. Cerrar sesión / Cambiar )

Foto de Facebook

Estás comentando usando tu cuenta de Facebook. Cerrar sesión / Cambiar )

Google+ photo

Estás comentando usando tu cuenta de Google+. Cerrar sesión / Cambiar )

Conectando a %s